Effects of tumor derived exosomes on T cells markers expression

Abstract Exosomes are 30-120nm bio particles transferred from donor to recipient cells leading to modification in their regulatory mechanisms depending upon the coded message in the form of loaded biomolecule. Cancer cells derived exosomes the true representatives of the parent cells have been found to modify the tumor surrounding/distinct regions and participate in metastasis, angiogenesis and immune suppression. Tis study was aimed to study the effects of tumor mice derived exosomes on the normal mice spleen isolated T cells by using co-culture experiments and flow cytometer analysis. We mainly focused on some of the T cells population and cytokines including IFN-, FOXP3+ regulatory T (Treg) cells and KI67 (proliferation marker). Overall results indicated random changes in different set of experiments, where the cancer derived exosomes reduced the IFN- expression in both CD4 and CD8 T cells, similarly the Treg cells were also found decreased in the presence of cancer exosomes. No significant changes were observed on the Ki67 marker expression. Such studies are helpful in understanding the role of cancer exosomes in immune cells suppression in tumor microenvironment. Cancer exosomes will need to be validated in vivo and in vitro on a molecular scale in detail for clinical applications.

Resumo Os exossomos são biopartículas de 30-120 nm transferidas de células doadoras para células receptoras, levando à modificação em seus mecanismos reguladores, dependendo da mensagem codificada na forma de biomolécula carregada. Verificou-se que exossomos derivados de células cancerosas os verdadeiros representantes das células-mãe modificam as regiões circundantes / distintas do tumor e participam da metástase, angiogênese e imunossupressão. Este estudo teve como objetivo estudar os efeitos de exossomos derivados de camundongos com tumor nas células T isoladas de baço de camundongos normais, usando experimentos de cocultura e análise de citômetro de fluxo. Concentrou-se, principalmente, em algumas populações de células T e citocinas, incluindo IFN-, células T reguladoras FOXP3 + (Treg) e KI67 (marcador de proliferação). Os resultados gerais indicaram mudanças aleatórias em diferentes conjuntos de experimentos, em que os exossomos derivados de câncer reduziram a expressão de IFN- em células T CD4 e CD8, da mesma forma que as células Treg também foram encontradas diminuídas na presença de exossomos de câncer. Nenhuma mudança significativa foi observada na expressão do marcador Ki67. Esses dados são úteis para a compreensão do papel dos exossomos do câncer na supressão de células do sistema imunológico no microambiente tumoral. Exossomos de câncer precisarão ser validados in vivo e in vitro em escala molecular com detalhes para aplicações clínicas.

Effects of tumor derived exosomes on T cells markers expression / Efeitos de exossomos derivados de tumor na expressão de marcadores de células T

Exosomes are 30-120nm bio particles transferred from donor to recipient cells leading to modification in their regulatory mechanisms depending upon the coded message in the form of loaded biomolecule. Cancer cells derived exosomes the true representatives of the parent cells have been found to modify the tumor surrounding/distinct regions and participate in metastasis, angiogenesis and immune suppression. Tis study was aimed to study the effects of tumor mice derived exosomes on the normal mice spleen isolated T cells by using co-culture experiments and flow cytometer analysis. We mainly focused on some of the T cells population and cytokines including IFN-γ, FOXP3+ regulatory T (Treg) cells and KI67 (proliferation marker). Overall results indicated random changes in different set of experiments, where the cancer derived exosomes reduced the IFN-γ expression in both CD4 and CD8 T cells, similarly the Treg cells were also found decreased in the presence of cancer exosomes. No significant changes were observed on the Ki67 marker expression. Such studies are helpful in understanding the role of cancer exosomes in immune cells suppression in tumor microenvironment. Cancer exosomes will need to be validated in vivo and in vitro on a molecular scale in detail for clinical applications.

Os exossomos são biopartículas de 30-120 nm transferidas de células doadoras para células receptoras, levando à modificação em seus mecanismos reguladores, dependendo da mensagem codificada na forma de biomolécula carregada. Verificou-se que exossomos derivados de células cancerosas ­ os verdadeiros representantes das células-mãe ­ modificam as regiões circundantes / distintas do tumor e participam da metástase, angiogênese e imunossupressão. Este estudo teve como objetivo estudar os efeitos de exossomos derivados de camundongos com tumor nas células T isoladas de baço de camundongos normais, usando experimentos de cocultura e análise de citômetro de fluxo. Concentrou-se, principalmente, em algumas populações de células T e citocinas, incluindo IFN-γ, células T reguladoras FOXP3 + (Treg) e KI67 (marcador de proliferação). Os resultados gerais indicaram mudanças aleatórias em diferentes conjuntos de experimentos, em que os exossomos derivados de câncer reduziram a expressão de IFN-γ em células T CD4 e CD8, da mesma forma que as células Treg também foram encontradas diminuídas na presença de exossomos de câncer. Nenhuma mudança significativa foi observada na expressão do marcador Ki67. Esses dados são úteis para a compreensão do papel dos exossomos do câncer na supressão de células do sistema imunológico no microambiente tumoral. Exossomos de câncer precisarão ser validados in vivo e in vitro em escala molecular com detalhes para aplicações clínicas.

Avaliação do perfil de microRNAs exossomais em portadores de hipercolesterolemia familial / Evaluation of the profile of exosomal microRNAs in patients with familial hypercholesterolemia

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença hereditária do metabolismo lipídico que causa aos portadores alta incidência de aterosclerose prematura. A HF pode ser diagnosticada clínica e geneticamente, entretanto, apenas cerca de 40% podem ter confirmados pelo diagnostico molecular. Assim, outros sistemas de diagnóstico devem ser avaliados. Ultimamente devido a estabilidade em fluidos biológicos, os exossomos circulantes apresentam grande potencial, pois carreiam um número variado de compostos e são considerados veículos de intercomunicação entre os tecidos. Sabe-se que vários RNAs são carreados nos exossomos, incluindo miRNAs, lncRNA e uma variedade de proteínas. Estes componentes podem ser marcadores de diagnóstico para várias doenças inclusive a HF e suas complicações cardiovasculares. Foram utilizadas amostras de exossomos plasmáticos provenientes de 54 pacientes HF sem uso de estatina por, no mínimo, seis semanas, e 38 indivíduos normolipidêmicos para sequenciamento de miRNAs e estudo da proteômica. Os exossomos foram isolados utilizando dois métodos precipitação química e cromatográfica de exclusão de tamanho e caraterizados utilizando: dispersão de luz dinâmica, Western blotting, rastreamento de nanopartículas (NanoSight), imunomarcação e microscopia eletrônica de transmissão. Os miRNAs e proteínas foram extraídos dos exossomos e analisados por sequenciamento de nova geração e espectrometria de massa, respectivamente. Os dados clínicos, biodemográficos e laboratoriais dos pacientes HF e controles indicaram diferenças significativas esperadas entre os grupos, indicando que foram selecionados adequadamente. A caracterização físico-química dos exossomos mostrou resultados com tamanho de ˜90nm e imunorreação positiva para tetraspaninas. O resultado do sequenciamento identificou acima 2000 miRNAs. Os miR-122- 5p e miR-21-5p apresentaram expressão aumentada no grupo HF (log2FC=1,79 e log2FC=1,27, respectivamente), e o miR-122-5p pós normalização em relação ao controle manteve significativo comparados ao controle (p=0,034). A análise comparativa entre exossomos e plasma total mostrou diferença significativa, pois foram identificadas 239 proteínas (p <0,05) diferentes entre exossomos e plasma. Em exossomos, 17 proteínas foram aumentadas e 21 diminuídas em pacientes com HF em comparação com o controle (p <0,05). Destas, seis proteínas foram mais abundantes em HF e sete proteínas foram menos abundantes em exossomos de pacientes com HF em comparação com o controle. A análise de enriquecimento por bioinformática mostrou que a maior parte dessas moléculas (miRNAs e proteínas) foram relacionadas com metabolismo lipídico, dislipidemia, aterosclerose, doença arterial coronariana, adipogênese. Assim, na busca de novos alvos como potenciais biomarcadores de diagnóstico da HF, nossos resultados da análise integrativa entre os miRNAs e as proteínas exossomais abre novas frentes de pesquisa mais bem direcionadas, para a validação desses miRNAs e proteínas exossomais

Familial Hypercholesterolemia (FH) is an inherited disease of lipid metabolism that causes a high incidence of premature atherosclerosis in patients. FH can be diagnosed clinically and genetically, however, only about 40% can be confirmed by molecular diagnosis. Thus, other diagnostic systems should be evaluated. Lately, due to stability in biological fluids, circulating exosomes have great potential, as they carry a varied number of compounds and are considered vehicles of intercommunication between tissues. Several RNAs are known to be carried on exosomes, including miRNAs, lncRNA, and a variety of proteins. These components can be diagnostic markers for several diseases including FH and its cardiovascular complications. Plasma exosome samples from 54 FH patients without statin use for at least six weeks and 38 normolipidemic individuals were used for miRNA sequencing and proteomics studies. Exosomes were isolated using two methods chemical precipitation and size exclusion chromatography and characterized using: dynamic light scattering, Western blotting, nanoparticle tracking (NanoSight), immunostaining and transmission electron microscopy. MiRNAs and proteins were extracted from exosomes and analyzed by next-generation sequencing and mass spectrometry, respectively. Clinical, biodemographic and laboratory data of FH patients and controls indicated significant expected differences between the groups, indicating that they were appropriately selected. The physicochemical characterization of exosomes showed results with a size of ˜90nm and positive immunoreaction for tetraspanins. The sequencing result identified above 2000 miRNAs. miR-122-5p and miR-21-5p showed increased expression in the FH group (log2FC=1.79 and log2FC=1.27, respectively), and miR122-5p after normalization in relation to the control remained significant compared to the control (p=0.034). The comparative analysis between exosomes and total plasma showed a significant difference, as 239 different proteins (p < 0.05) were identified between exosome and plasma. In exosomes, 17 proteins were increased and 21 decreased in FH patients compared to control (p < 0.05). Of these, six proteins were more abundant in FH and seven proteins were less abundant in exosomes from patients with FH compared to the control. Bioinformatics enrichment analysis showed that most of these molecules (miRNAs and proteins) were related to lipid metabolism, dyslipidemia, atherosclerosis, coronary artery disease, adipogenesis. Thus, in the search for new targets as potential diagnostic biomarkers of FH, our results of the integrative analysis between miRNAs and exosomal proteins opens new and better-directed research fronts for the validation of these miRNAs and exosomal proteins

Aislamiento y caracterización celular de exosomas de plasma para su uso como biomarcadores de diagnóstico / Isolation and cellular characterization of exosomes from plasma for their use as diagnostic biomarkers / Purificação e caracterização celular de exossomos para seu uso como biomarcadores de diagnóstico

Los exosomas son vesículas membranosas extracelulares esenciales en la comunicación intercelular a larga distancia, viajan en los fluidos corporales y entregan mensajes moleculares dirigidos a la mayoría de las células de todo el organismo. La liberación de mensajes vía exosomas ocurre en forma de ADN, ARN o proteínas; dicha liberación se ha asociado a diferentes condiciones fisiológicas normales y patológicas, como el cáncer. Por lo anterior, el aislamiento eficiente y caracterización celular de exosomas de plasma es clave para su uso como biomarcadores no invasivos de diversas enfermedades. En el presente estudio se purificaron exosomas a partir de muestras clínicas de plasmas de pacientes previamente diagnosticados con retinoblastoma y de individuos sanos como control. Los exosomas recuperados fueron caracterizados a nivel celular por microscopia electrónica de transmisión empleando una técnica de criogenia. Para demostrar la correcta purificación de exosomas se confirmó la presencia de las proteínas transmembranales CD63 y CD81 mediante immunoblot. Adicionalmente de los exosomas purificados, se identificaron ARNs pequeños no codificantes llamados microARNs. En general, se describe la purificación y caracterización celular de exosomas obtenidos de plasma humano para su potencial uso como biomarcadores.

Exosomes are small extracellular vesicles essential in intercellular communication; they act as vehicles of broad scope. They are travelling in body fluids and delivering molecular messages to cells in the organism. Messages released by exosomes like DNA, RNA and proteins are associated with different pathological conditions including cancer. Therefore, the efficient isolation and cellular characterization of exosomes from plasma is essential to use them as biomarkers in many diseases. Here, exosomes were purified from patients diagnosed with pediatric cancer and healthy individuals as control. The exosomes recovered were characterized using cryogenic transmission electron microscopy. Moreover, the presence of CD63 and CD81 transmembrane proteins was confirmed using Western blot. Besides, miRNAs presence was identified from exosomes. This work describes a complete technique to isolate and characterize exosomes from human plasma, recognizing their potential as biomarkers.

Os exossomos são vesículas membranosas extracelulares essenciais na comunicação intercelular de longa distância; eles viajam em fluidos corporais e entregam mensagens moleculares dirigidas à maioria das células de todo o organismo. A liberação de mensagens através dos exossomos ocorre em forma de DNA, RNA ou proteínas; essa liberação foi associada a diferentes condições fisiológicas normais e patológicas, tais como o câncer. Por tudo isso, o eficiente isolamento e caracterização celular de exossomos de plasma é chave para sua utilização como biomarcadores não invasivos de várias doenças. No presente estudo, exossomos foram purificados a partir de amostras clínicas de plasmas de pacientes que tinham sido diagnosticados previamente com retinoblastoma e de indivíduos saudáveis como controle. Os exossomos recuperados foram caracterizados a nível celular por microscopia eletrônica de transmissão usando uma técnica de criogenia. Para demonstrar a correta purificação dos exossomos, foi confirmada a presença de proteínas transmembranares CD63 e CD81 usando inmunoblot. Além dos exossomos purificados foram identificados ARNs não codificantes pequenos chamados microARNs. Em geral os métodos de purificação e caracterização celular de exossomos obtidos de plasma humano são descritos por seu potencial utilização como biomarcadores.

Análise do papel dos exossomos derivados das linhagens celulares SCC-15 e HSC-3 no processo de angiogênese tumoral / Analysis of the role of exosomes derived from cell lines SCC-15 and HSC-3 in the process of tumor angiogenesis

Os exossomos são vesículas extracelulares originadas por brotamento interno da membrana de endossomos tardios que representam uma eficiente forma de comunicação intercelular. Devido às suas múltiplas funções biológicas, o foco de alguns estudos atuais tem se concentrado na análise do seu papel no desenvolvimento do câncer, progressão da doença, invasão, angiogênese e formação de metástases tumorais. Nesta perspectiva, o presente estudo objetivou caracterizar os exossomos secretados por duas linhagens celulares de carcinomas epidermoide oral (CEO) (SCC-15 e HSC-3) e avaliar seus efeitos sobre uma linhagem de células endoteliais (HUVEC), em relação à sua capacidade de formação de estruturas vasculares, taxas de migração, proliferação e índices de apoptose/necrose. Médias significativamente maiores de células com potencial invasivo (p<0,0001) e migratório (p<0,0001) foram observadas para a linhagem HSC-3. Ultraestruturalmente, verificou-se que as partículas derivadas da linhagem SCC-15 exibiram morfologia arredondada e diâmetro inferior a 150 nm. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi revelada entre as linhagens celulares estudadas, considerando a quantificação de nanovesículas (p=0,2252) e tamanho exossomal (p=0,1765). Por imunofluorescência indireta, identificou-se que 22,15% dos exossomos secretados pelas células SCC-15 e 18,37% dos exossomos derivados da linhagem HSC-3 expressaram o anticorpo anti-Anexina. No que se refere aos ensaios funcionais com as HUVECs, o tratamento com exossomos derivados da linhagem SCC-15 induziu um aumento significativo da capacidade de formação de estruturas vasculares (p<0,0001), potencial migratório (p=0,0016) e taxa de apoptose (p<0,0001), enquanto que uma redução da proliferação celular foi apontada (p=0,0030). Por outro lado, o tratamento com exossomos secretados pela linhagem HSC-3 promoveu uma redução significativa da formação tubular (p<0,0001), motilidade (p=0,0042) e proliferação celular (p=0,0010), ao passo que nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada no índice apoptótico (p=0,3004). Os resultados do presente estudo indicaram a participação dos exossomos derivados de linhagens de CEO no processo de angiogênese tumoral, onde as células SCC-15 exibiram forte resposta proangiogênica e a linhagem HSC-3 demonstrou efeito antiangiogênico (AU).

Exosome are extracellular microvesicles originated by inward budding of late endosomal membrane that represent an efficient form of intercellular communication. Because of its multiple biological functions, the focus of some recent studies has concentrated on the analysis of its role in cancer development, disease progression, invasion, angiogenesis and tumor metastasis formation. In this perspective, the present study aimed to characterize the secreted exosomes by two cell lines of oral squamous cell carcinomas (OSCC) (SCC-15 and HSC-3) and to evaluate its effects on a cell line of endothelial cells (HUVEC), in relation to their ability to form vascular structures, rates of migration, proliferation, and apoptosis / necrosis indices. Significantly higher means of cells with invasive (p<0.0001) and migratory potential (p = <0.0001) were observed for the HSC-3 cell line. Ultrastructurally, it was found that particles derived from the SCC-15 cell line exhibited a rounded morphology and diameter of less than 150 nm. No statistically significant difference was revealed between the studied cell lines, considering the nanovesicles quantization (p=0.2252) and exossomal size (p=0.1765). By indirect immunofluorescence, it was found that 22.15% of exosomes secreted by SCC-15 cells and 18.37% of exosomes derived from HSC-3 cells expressed anti-annexin antibody. With regard to the functional tests with HUVECs, treatment with exosomes derived from SCC-15 cell line induced a significant increase in their capacity of formation of vascular structures (p = <0.0001), migratory potential (p=0.0016) and rate of apoptosis (p<0.0001), while a decrease in cell proliferation was noted (p = 0.0030). On the other hand, the treatment with exosomes secreted by HSC-3 cell line produced a significant reduction in tubule formation (p<0.0001), motility (p = 0.0042) and cell proliferation (p=0.0010), whereas no statistically significant difference was observed in the apoptotic index (p=0.3004). The results of this study indicated the involvement of exosomes derived from OSCC cell lines in tumor angiogenesis process, in which the SCC-15 cells exhibited strong proangiogenic response and HSC-3 cell line showed antiangiogenic effect (AU).

Análise do comportamento das linhagens celulares SCC-25, SAS e HSC-3 frente à presença dos exossomos derivados dos macrófagos (TAMs) dos subtipos M1 e M2 / Analysis of the behavior of cell lines SCC-25, SAS and HSC-3 against the presence of exosomes derived from macrophages (TAMs) of subtypes M1 and M2

O carcinoma epidermóide (CE) de língua representa uma das lesões malignas mais comuns em cavidade oral e caracteriza-se por apresentar um comportamento localmente invasivo e agressivo. Os exossomos são responsáveis pela comunicação célula-célula e podem influenciar na progressão tumoral, metástase e eficácia terapêutica. Dentre as células capazes de secretar exossomos estão as células tumorais e as células imunes. Sabe-se que a presença das células imunes é importante para erradicar os tumores. No entanto, achados recentes demonstram que a inflamação pode promover o crescimento tumoral. Os macrófagos associados a tumores (TAMs) são conhecidos por apresentarem diferentes subtipos, M1 e M2, capazes de secretarem exossomos. O presente estudo se propôs a observar o comportamento dos exossomos derivados dos TAMs, dos subtipos 1 e 2, frente a cultura de células humanas SCC-25, HSC-3 e SAS derivadas de CE de língua, por meio da análise da capacidade de invasão, proliferação e viabilidade das células tumorais na presença dos exossomos. Observou-se que as microvesículas derivadas dos TAMs apresentam positividade para CD63, caracterizando-as como exossomos. Os exossomos dos TAMs do subtipo M2 foram os únicos a apresentarem marcação para TGF-ß, quando em comparação com os exossomos M1, THP1 e das linhagens celulares de CE, sugerindo que os exossomos M2 podem ser responsáveis pela expressão de TGF-ß nas células tumorais, uma vez que são internalizados. Nos ensaios de migração, observou-se que as células SCC-25 em presença de meio de cultura DMEM F/12, apresentaram maior capacidade de invasão frente aos exossomos M2 (p≤0,001), para concentração de 0,1 µg/ml. Para as células HSC-3 e SAS, não foi observada relação estatisticamente significante entre a presença de exossomos cultivados juntamente com as células tumorais e a capacidade de invasão celular (p>0,05). Quando os exossomos foram colocados no compartimento inferior do transwell, as células HSC-3 em presença dos exossomos M2 (1,0 µg/ml) apresentaram maior capacidade de invasão (p≤0,001). O teste de viabilidade demonstrou que as células HSC-3 tornam-se mais viáveis frente à presença dos exossomos M2 (p≤0,001) na concentração de 50 µg/ml. Para as células SCC-25, o resultado foi o mesmo (p≤0,05). A imunofluorescência demonstrou a internalização dos exossomos nas linhagens celulares estudadas. Os achados sugerem que a presença de exossomos M2, frente às culturas de células de CE de língua, pode ser um campo de pesquisa importante para futuros estudos com terapias-alvo (AU).

Squamous cell carcinoma (SCC) of the oral tongue is one of the most common malignant lesions in the oral cavity and is characterized by presenting a locally invasive and aggressive behavior. The exosomes are responsible for cell-cell communication and may influence tumor progression, metastasis and therapeutic efficacy. Among the cells that can secrete exosomes are tumor cells and immune cells. It is known that the presence of immune cells is important to eradicate tumors. However, recent findings suggest that inflammation may promote tumor growth. The tumor associated macrophages (TAMs) are known to have subtypes, M1 and M2, that secrete exosomes. This study's goal was to observe the behavior of derivatives TAMs exosomes, subtypes 1 and 2, against human cell culture SCC-25, HSC-3 and SAS derived from SCC of oral tongue, through the analysis of invasiveness, proliferation and viability of tumor cells in the presence of exosomes. It was observed that the microvesicles derived from TAMs are positive for CD63, characterizing them as exosomes. The exosomes of the M2 subtype TAMs were the only ones to present TGF-ß marking, as compared with M1 exosomes, THP1 and SCC cell lines, suggesting that M2 exosomes may be responsible for TGF-ß expression in tumor cells. In the migration tests, it was found that the SCC-25 cells in the presence of culture medium DMEM F / 12 showed higher invasion capacity in the presence of M2 exosomes (p≤0,001) to a concentration of 0.1 µg/ml. For HSC-3 and SAS cells, there was no significant statistical relationship between the presence of exosomes and invasiveness (p> 0.05) for the exosomes derived from TAMs. When the exosomes were placed in the lower compartment of the transwell, the HSC-3 cells in the presence of M2 exosomes (1.0 µg/ml) had higher invasiveness (p≤0,001). The viability test showed that HSC-3 cells became more viable in the presence of M2 exosomes (p≤0.001) at a concentration of 50 µg/ml. For SCC-25 cells, the result was the same (p≤0.05). Immunofluorescence showed the internalization of exosomes in the cell lines studied. These findings suggest that the presence of M2 exosomes in the SCC of the oral tongue cell cultures may be an important research field for future studies of targeted therapies (AU).

Análise proteômica e identificação de RNAs longos não codificantes em exossomos de plasma de pacientes com Leucemia Mielóide Crônica / [ Proteomic analysis and identification of long non-coding RNAs in plasma exosomes of patients with Chronic Myeloid Leukemia]

A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa ocasionada pela translocação recíproca entre o oncogene ABL 1, localizado no cromossomo 9, com o gene BCR, localizado no cromossomo 22 [t9,22], originando um novo cromossomo, denominado Philadelphia. A proteína quimérica da translocação BCR-ABL possui atividade tirosino-quinase aumentada e anormal. Apesar da contribuição indubitável da proteína BCR-ABL, alguns estudos já evidenciaram que as células-tronco leucêmicas podem ser independente de BCR-ABL para sobreviver, indicando que alguns fatores presentes no microambiente tumoral, como as microvesículas e exossomos, podem sustentar as células-tronco leucêmicas (LSCs). Os exossomos, também denominados de nanovesículas, possuem de 40 a 100nm de diâmetro, são responsáveis pela comunicação intercelular e tem ganhado atenção nos últimos anos, devido a grande quantidade de moléculas e substâncias que podem transportar de uma célula a outra, ativando importantes vias de sinalização. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi purificar os exossomos do plasma de medula óssea de pacientes com LMC em fase crônica da doença ao diagnóstico, caracterizar o perfil imunofenotípico, realizar uma análise proteômica Label Free para identificar o perfil proteômico e identificar os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) presente no interior destes exossomos. Foram identificadas 341 proteínas diferencialmente expressas entre pacientes com LMC e doadores, e a proteína BOC, receptor da via de Hedgehog (Hh), estava aumentada na amostra dos pacientes. O perfil imunofenotípico revelou que os exossomos foram purificados com sucesso e que, provavelmente, estavam sendo secretados pelas células mesenquimais, megacariócitos e granulócitos no microambiente da medula, uma vez que houve aumento da diferencça de média de intensidade de fluorescência (dMIF) para as tetraspaninas consideradas marcadoras destas populações celulares, respectivamente (CD105, CD61 e CD65). Em relação ao lncRNAs, ANTINOS2A, RoR, SFMBT2 e VLDLR apresentaram reprodutibilidade dos dados em amostras dos doadores, estando ausentes nos pacientes. Neste grupo somente o lncRNA HOTAIR apresentou-se diferencialmente expresso com um fold-change de 13,24. Nossos dados permitem inferir que os exossomos presentes no plasma de pacientes com LMC são capazes de carrear conteúdo molecular, de ativar a via de Hh e, assim, favorecer a leucemogênese no início da LMC.

Regulação da atividade de STAT3 e o papel da proteína STI1/Hop secretada em glioblastoma / Regulation of STAT3 activity and the role of secreted STI1/Hop in glioblastoma

O Glioblastoma (GBM) é o tumor de células gliais mais comum e agressivo dentre os tumores cerebrais primários. Caracterizar mecanismos moleculares associados com a progressão desse tumor pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias para seu tratamento e garantir a maior sobrevida de pacientes. A proteína STAT3 (Proteína transdutora de sinal e ativadora de transcrição 3) é um fator de transcrição ativado por fosforilação e conhecido por seu importante papel na gliomagênese. Com o uso de microarranjos de tecidos (TMAs) avaliamos a expressão total e a localização nuclear de STAT3 e de suas formas fosforiladas pSTAT3 (Y705) e pSTAT3(S727) em astrocitomas e tecido cerebral não tumoral. STAT3 possui uma localização nuclear aumentada em GBMs humanos, quando comparada com astrocitomas de menor grau ou tecido cerebral não tumoral. Interessantemente, o aumento da localização nuclear de STAT3 nos GBMs não está associado com o incremento de suas formas fosforiladas. Além disso, altos níveis de STAT3 nuclear em GBM estão correlacionados com o menor tempo livre de recidiva e a uma menor sobrevida nesses pacientes. Esse perfil não foi visto para as formas fosforiladas, indicando que outros mecanismos de ativação de STAT3, que não a via canônica de fosforilação, podem estar presentes nos GBMs. A identificação dessas modificações pode representar uma nova estratégia terapêutica para a abordagem desses tumores uma vez que as drogas disponíveis atualmente têm como alvo os domínios fosforilados de STAT3. Uma modificação pós-traducional que poderia contribuir para a translocação nuclear de STAT3 é a SUMOilação. A proteína PIAS1 (Proteína inibidora da atividade de STAT1) está envolvida neste mecanismo por mediar a adição de SUMO (Pequena proteína modificadora relacionada à ubiquitina) às proteínas-alvo. Nossos dados mostraram que PIAS1 apresenta maior localização nuclear em GBM quando comparado ao tecido não tumoral...

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain tumor. This work was conducted to characterize molecular mechanisms associated with GBM progression that could assist in developing of new strategies for its treatment and ensure better overall survival of these patients. STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) is a transcription factor activated by phosphorylation and known for its important role in gliomagenesis. Using tissue microarrays (TMAs) we evaluated the total expression and nuclear localization of STAT3 and its phosphorylated forms, pSTAT3 (Y705) and pSTAT3 (S727) in astrocytomas and non-tumor brain tissue. GBMs showed higher levels of nuclear STAT3 compared to lower grade astrocitomas or non-tumor brain tissue. Interestingly, increased nuclear STAT3 in GBMs is not associated with the improvement of its phosphorylated forms. Moreover, high levels of nuclear STAT3 in GBMs correlate with lower free-recurrence survival and overall survival of these patients. This profile followed by its phosphorylated forms, indicating that other activation mechanisms besides than the canonical STAT3 phosphorylation is present in GBM. The identification of these post-translation modifications may represent new therapeutic strategies for the treatment of these tumors since the currently available drugs target only the phosphorylation sites of STAT3. A posttranslational modification that could contribute to nuclear translocation of STAT3 is the SUMOylation although we were unable to see this interaction in cultured cells. On the other hand, GBMs have a higher nuclear PIAS1 compared to non-tumor brain tissue. PIAS1 protein (Protein Inhibitor of Activity of STAT1) is involved in protein SUMOylation by mediating the addition of SUMO to target proteins. Moreover, PIAS1 promotes nuclear retention of the co-chaperone STI1/Hop (Stress inducible protein 1/Hsp70- Hsp90 organizing protein) in astrocytes treated with gamma radiation, which may...

Solução salina hipertônica na insuficiência cardíaca descompensada / Hypertonic saline solution in decompensated heart failure

A ocorrência de disfunção renal em pacientes com insuficiência cardíaca descompensada é evento comum e associado a pior prognóstico. Entretanto, intervenções direcionadas a prevenção e tratamento da disfunção renal nestas circunstâncias revelaram resultados desapontadores. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da solução salina hipertônica (SSH) para a prevenção de disfunção renal em pacientes com insuficiência cardíaca descompensada. Trata-se de ensaio clínico duplo-cego e randomizado no qual pacientes com insuficiência cardíaca descompensada foram alocados para receber 100 ml de SSH (NaCl 7,5 por cento) ou placebo (NaCl 0,9 por cento) duas vezes ao dia por três dias. O desfecho primário foi a elevação igual ou superior a 0,3 mg/dl da creatinina sérica; o desfecho secundário foi a elevação de biomarcadores da função renal, e incluiu creatinina, cistatina C, lipocalina de neutrófilos associada a gelatinase (NGAL), excreção urinária da isoforma A1 do transportador de uréia, da isoforma 3 do trocador de Na+/H+ e de aquaporina 2 . Ao todo, 22 pacientes foram alocados no grupo SSH e 12 no grupo placebo. O desfecho primário ocorreu em 2 (10 por cento) pacientes no grupo SSH e em 6 (50 por cento) pacientes no grupo placebo (risco relativo 0,3; intervalo de confiança 95 por cento de 0,09 a 0,98; P=0,01). Ao longo da intervenção, a concentração sérica tanto de creatinina como de cistatina C mantiveram-se estáveis no grupo HSS e elevaram-se no grupo placebo (p=0,004 e p=0,03, respectivamente). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos em relação à concentração sérica de NGAL. A expressão urinária dos transportadores de membrana de células tubulares esteve aumentada no grupo SSH em comparação ao grupo placebo, tanto para a isoforma A1 do transportador de uréia, quanto para a isoforma 3 do trocador de Na+/H+ e da isoforma 2 da aquaporina. Nossos dados permitem concluir que a administração de SSH pode atenuar a ocorrência de disfunção renal em pacientes com insuficiência cardíaca...

The occurrence of renal dysfunction is frequent among patients with decompensated heart failure and is associated with increased mortality. However, interventions targeted to prevention of renal dysfunction in this setting have been disappointing. The objective of this study was to investigate the effects of hypertonic saline solution for prevention of renal dysfunction in patients admitted for decompensated heart failure. This study is a double-blind randomized trial, in which patients with decompensated heart failure were assigned to receive a three-day course of 100ml of hypertonic saline solution (HSS - NaCl 7.5 percent) twice daily or placebo. The primary end point was an increase in serum creatinine of 0.3mg/dL or more. Main secondary end points were changes in biomarkers of renal function, including serum levels of creatinine, cystatine C, neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and the urinary excretion of aquaporin 2, urea transporter A1, and sodium/hydrogen exchanger 3. Altogether, 22 patients were assigned to HSS and 12 to placebo. The primary end point occurred in two (10 percent) patients in HSS group and six (50 percent) in placebo group (relative risk 0.3; 95 percent CI 0.09 - 0.98; P=0.01). Relative to baseline, serum creatinine and cystatin C levels were lower in HSS as compared to placebo (P=0.004 and 0.03, respectively). NGAL level was not statistically different between groups, however the urinary expression of aquaporin 2, urea transporter A1, and sodium/hydrogen exchanger 3 were significantly higher in HSS than in placebo. Therefore, the present data suggest that the administration of hypertonic saline solution to patients with decompensated heart failure may attenuate heart failure-induced acute kidney injury as indicated by improvement in both glomerular and tubular defects, a finding with important clinical implications...